Curso: APLICACIONES DEL CULTIVO CELULAR

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La Dra Lydia Guadalupe Rivera Morales, como miembro del CTA, realizó la apertura del Curso-Taller con unas palabras donde describe la importancia de realizar actividades académicas que apoyen a la capacitación y difusión del conocimiento de expertos a profesores y alumnos en formación. Después de leer el resumen curricular de los ponentes inauguró formalmente el evento.

El IBT Manuel Jaime Rodríguez representa la Jefatura de Tecnología Celular en Laboratorios de Especialidades Inmunológicas S.A. de C.V., laboratorio Tercero Autorizado por COFEPRIS para el análisis de control de calidad en medicamentos biológicos y biotecnológicos para verificar su eficiencia y confiabilidad. El ingeniero actualmente estudia la Maestría en Sistemas de Calidad y ha laborado 6 años en la industria biotecnológica adquiriendo gran experiencia multidisciplinaria en: cultivo celular con más de 30 líneas celulares, control de calidad de biotecnológicos, trabajo aséptico, lean manufacture, diseño y promoción de servicios en biotecnología.

En México no se libera un lote de biológicos y/o biotecnológicos sin antes ser analizado por un tercer autorizado, de ahí la importancia del trabajo realizado por este tipo de laboratorio.
Menciona que para el 2022 se espera que los productos biológicos y biotecnológicos terapéuticos para uso oncológico sean los de mayor mercado y de mayor crecimiento a nivel mundial.

Se expusieron las diferentes maneras en las que mediante el uso de células de mamífero se pueden producir virus, anticuerpos monoclonales y proteínas glicosiladas.
La caracterización del organismo productor es imprescindible para la producción de biotecnológicos.
El control de glucosa y glutamina a bajas concentraciones aumenta la eficiencia de producción.

Existen varias variables importantes a monitorear dentro de un bioproceso. La hipotermia leve a 31°C, considerando los 37 grados como óptimos para el cultivo celular, incrementa el rendimiento de metabolitos secundarios de interés, como proteínas, y disminuye el tiempo de producción.

Existen varias variables importantes a monitorear dentro de un bioproceso. La hipotermia leve a 31°C, considerando los 37 grados como óptimos para el cultivo celular, incrementa el rendimiento de metabolitos secundarios de interés, como proteínas, y disminuye el tiempo de producción.

INGENIERÍA DE TEJIDOS
La ingeniería que combina células, biomateriales y moléculas para la generación de tejidos, como hueso, piel, dientes, retina, cartílago y órganos como orejas.
Las células son básicamente los bloques de construcción, el biomaterial es el soporte que crea una matriz extracelular que da soporte, guía y microentorno para interacción entre células.
Las moléculas son las indicaciones que va a tener la matriz celular.
El gran reto en la ingeniería de tejidos es la vascularización y la polaridad.
Hay órganos sencillos con morfología homogénea pero hay otros de morfología heterogénea que requieren de mayor ingeniería.
Las células troncales juegan un papel importante en el futuro de la ingeniería de tejidos pero falta la comprensión de muchos procesos biológicos para lograr el potencial que tiene.
La impresión de órganos en 3D requiere un mayor desarrollo en la generación de órganos complejos.

BIOENSAYOS
El desarrollo de un medicamento implica desde la ciencia básica, la parte pre-clínica en animales hasta la parte de ensayos clínicos que permiten la liberación y posterior registro para su venta.
Cada etapa tiene una razón de ser y es importante seguirla en cumplimiento de la normatividad mexicana dentro de un Marco Regulatorio. No podemos realizar estudios en animales sin antes caracterizar por completo la molécula y mucho menos iniciar estudios en humanos si no hemos completado el estudio en animales.
La Farmacovigilancia es la que se encarga de que se lleve a cabo cada una de las etapas requeridas antes de que una molécula salga al mercado.

El Marco Regulatorio para el desarrollo de un medicamento está compuesto por:
– La Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos, Artículo 4.
– Ley General de Salud, Artículos 43, 194 Bis, 195, 368 y 379.
– Reglamento de Insumos para la Salud, Artículo 162, 164
– Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos
– Norma Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-2015
– Norma Oficial Mexicana NOM-073-SSA1-2015

Específicamente, para el tipo de medicamento que tienen ustedes en desarrollo, el Artículo 43 de la Ley General de Salud (LGS) especifica que para la distribución o venta de los productos de origen biológico y hemoderivados de fabricación, Ácidos necleicos sintéticos o de plásmidos nacional o extranjera, se requiere que cada lote sea previamente autorizado con base en los resultados analíticos emitidos por la Secretaría de Salud o por un Tercero Autorizado de acuerdo con la Norma correspondiente, con excepción de los productos provenientes de los lisados bacterianos y de las preparaciones microbianas para uso oral no inmunológico.

Básicamente es la Comisión de Control Analítico y Aplicación de Cobertura CCAYAC es el responsable de verificar el control de calidad de las moléculas previa venta; también es el único que puede evaluar a un Tercer Autorizado para el mismo fin. Estos también pueden ser evaluados aleatoriamente por la COS o Comisión de Operación Sanitaria.

La complejidad de evaluar un medicamento alopático vs una biomolécula es significativamente diferente.
Según la LGS Artículo 299, los productos de origen biológico son:
– Toxoides, vacunas y preparaciones bacterianas de uso parenteral;
– Vacunas virales de uso oral o parenteral;
– Sueros y antitoxinas de origen animal;
– Hemoderivados;
– Vacunas y preparaciones microbianas para uso oral;
– Materiales biológicos para diagnóstico que se administran al paciente;
– Antibióticos;
– Hormonas macromoleculares y enzimas, y
– Las demás que determine la Secretaría de Salud.

Se clasifican como medicamentos biotecnológicos:
– Proteínas recombinantes
– Anticuerpos monoclonales
– Péptidos sintéticos (MD 40 a.a)
– Los demás que, en su caso, determine mediante acuerdo la Secretaría, conforme a los avances técnicos y científicos.

Tanto para productos biológicos como biotecnológicos el dato de calidad de interés es la potencia o actividad que tiene cada dosis, dada en unidades/ml o unidades/mg. Cada unidad de potencia se definirá según el grupo de producción, animal en el que se probó u otra estandarizada.

Existe un estándar biológico Internacional basado en un estudio colaborativo de resultado promedio, para el cual la asignación de la potencia en UI del primer estándar se hace arbitrariamente.
Por ejemplo, para establecer la definición de Unidad Internacional del hemoderivado Factor VIII, intervinieron 38 laboratorios a nivel internacional, mismos que fueron instruidos en el uso de las recomendaciones de la ISTH/SSC, por sus siglas en inglés: The Scientific and Standardization Committee (SSC). Estos Laboratorios publican sus resultados, se aplica estadística y se unifica en el National Institute for Biological Standards and Control, quien evalúa y selecciona el preparado que funcionará como estándar internacional para medición de potencia en unidades internacionales.

Los bioensayos son pruebas diseñadas para determinar la cantidad de sustancia activa en una mezcla compleja, midiendo el efecto en un proceso bioquímico o sistema biológico, y se emplean para ensayar ciertas sustancias cuya potencia no puede ser determinada por medios químicos o físicos.

El principio por aplicar, siempre que sea posible, será el de comparación con una preparación de referencia, con el fin de establecer que la muestra probada produce el mismo efecto biológico que una cantidad dada de la preparación estándar (la unidad).
La cleve de validez de un bioensayo está en los registros en tiempo y forma que se hagan del mismo y su posterior análisis estadístico por línieas paralelas mediante Software, con criterios estadísticos bien definidos que se tienen que cumplir para que dicho software pueda iniciar con el análisis. Los límites de confianza (P=0.95) de la actividad estimada están comprendidos entre 64% y 156% de la actividad indicada.

DESARROLLO DE TERAPIAS QUE UTILIZAN CÉLULAS MADRE.
Terapia celular es la restauración de órganos y tejidos dañados como consecuencia de lesiones traumáticas o a causa de alguna enfermedad degenerativa, a través de la selección de células madre o células de órgano específico.
Pasos de la Terapia Celular

Actualmente solo se tiene autorizado trabajar con células derivadas de médula ósea. Cuando el proceso inicia con el aislamiento de células del órgano impactado del paciente, estas células deben ser caracterizadas cumpliendo con las tres (3) condiciones que rige la Sociedad Internacional de Terapia Celular. Para todo aquel paciente que requiere de células estromales mesenquimales, se tiene que cumplir con: la morfología, la diferenciación celular en tres linajes (osteoblasto, condroblasto y adiposito) y con el inmunofenotipo positivo a marcadores específicos.
Una Célula Madre es aquella que se encuentra en todos los organismos multicelulares, se pueden renovar y diferenciar en diversos tipos de células especializadas. Hay dos grandes tipos: células madre embrionarias y células madre adultas. En los organismos adultos, las células madre y células progenitoras actúan como un sistema de reparación para el cuerpo en vías de reposición de los tejidos adultos.

Se clasifican según su potencial de diferenciación en:
– Totipotenciales. Células que pueden originar a un nuevo individuo.
– Pluripotenciales. Células del 4° día posterior a la fecundación del ovocito, que ya no son capaces de formar a un individuo completo pero si de formar cualquier tipo celular.
– Multipotentes. Células presentes en tejido humano adulto, en el feto y en el cordón umbilical, que generan tipos celulares concretos.
Por cuestiones éticas y morales no está permitido trabajar con células embrionarias pero desde 1868 se demostró que la médula ósea es productora de elementos y factores que generan este tipo de células específicas.

El Premio Nobel de Medicina del 2012 fue para John B. Gurdon y Shinya Yamanaka, investigadores que demostraron que existe la transdiferenciación, es decir, células de médula ósea, ya maduras, que portan los genes que las células embrionarias tienen para la diferenciación, genes que permiten la capacidad de reprogramación celular para generar células inmaduras, pluripotenciales inducidas. Para lo anterior se requiere de 4 genes principalmente, factores de diferenciación y estimulación.
Las terapias aceptadas al 2017 son las que tienen la finalidad de substituir la función de la médula ósea:
– Trasplante de células hematopoyéticas obtenidas de células de médula ósea
– Trasplante de células progenitoras de sangre periférica y
– Trasplante de células hematopoyéticas obtenidas de cordón humbilical (FDA 2014)
– Terapias de piel con halotrasplantes a través de queratinocitos. 2012
RE-CELL producto obtenido de adipositos, con uso aprobado en Canadá, México, Europa y otros países.
– Células limbales de la zona conservada de la córnea del paciente, se cultivan en laboratorio y se transfieren a la zona dañada. Cuenta con autorización sanitaria en Australia.

Las aún NO aceptadas pero en proceso de desarrollo:
– NurOwn de BrainStorm Cell Therapeutics, para tratamiento de Esclerosis lateral amiotrófica con células madre adultas. Espera tener autorización en Canadá para el 2018.
– Células pluripotenciales inducidas para retina. Desarrollo en Hospital John Hopkins de Estados Unidos.
– Células madre cardiacas o derivadas de la médula ósea CD63+/CD90+ HLA1, con aplicación de una infusión intravascular (intravenosa, intracoronaria) o bien por una inyección intramiocardial (uso de un catéter) para reparación del miocardio o la regeneración post-infarto.
– Infusión autóloga de islotes de células beta pancreáticas, combinada con células mesenquimales: inmunomoduladores y angiogénicas contra la diabetes.
– Células mesenquimales autólogas en estudio clínico Fase II para Esclerosis Múltiple, Desarrollo Cerebral y del Sistema Nervioso.
– TIGENIX células de condrocito, en ensayo clínico Fase III para el tratamiento de fisuras perianales complejas en pacientes con enfermedad de Crohn.
La siguiente tabla muestra las ventajas y desventajas de diversos tipos de células madre para medicina regenerativa.
Hablando en general, aún NO está aprobada la terapia con células madre a nivel mundial, es RE-CELL la que tiene autorización en mayor número de paíces como Canadá, México y Europa para regeneración de piel.

CONTROL DE CALIDAD EN BANCOS DE CÉLULAS.
Cultivo Celular es un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Los Bancos se Células suponen el uso de un sistema de depósito de células congeladas con dos niveles: un banco de células maestro (BCM) y un banco de células de trabajo (BCT).
Existe el Consorcio de código de barras de la vida CBOLD, creado en 05/04, que es una base de datos internacional colaborativa de secuencias de nucleótidos.

Las Buenas Prácticas de Laboratorio incluyen: manipulación, documentación, registro, rastreabilidad y trazabilidad, limpieza y mantenimiento de equipos con su validación y calificación, protocolos de uso y técnicas empleadas.
El valor de un cultivo reside en:
– Su estabilidad genética
– Inexistencia de microorganismos contaminantes
– Pureza de la línea establecida (autenticidad e identidad)
– Funcionalidad para bioensayos y/o análisis
Identidad celular: ADN Barcode CO1
– Líneas celulares Humanas: HeLa
– Líneas celulares Murinas: M-NFS-60, L929
– Líneas celulares de Hámster Chino: CHO K1
– Línea celular de Mono Verde: Vero

La clave es elegir el gen correcto para que sirva como código de barras, por eso se eligen secuencias muy conservadas en las especies.
Los patrones específicos de especies A, C, G y pueden ser usados para la identificación.
Los individuos dentro de una especie pueden variar ligeramente en secuencia. El ADN sirve como código de barras para la identificación de especies.
Estabilidad Genética: ICH Q5B

El constructo de expresión se define como el vector de expresión que contiene la secuencia codificante de la proteína recombinante de interés. Se caracteriza la expresión del constructo y la proteína purificada para asegurar la producción consistente de un producto derivado de ADN recombinante.
El análisis de la expresión a nivel de ácidos nucleicos debe considerarse como:
– Evaluación de la calidad, teniendo en cuenta que esta prueba sólo evalúa la secuencia de codificación de un gen recombinante y no la fidelidad traduccional u otras caracteríatizas del gen.
– Incorporación correcta de la secuencia codificante del producto dentro de la célula huésped .
– Los métodos analíticos no pueden detectar las variaciones en la secuencia del constructo, lo que sí hacen los métodos moleculares.
– Secuenciación del constructo.

El control microbiológico contempla detección de Mycoplasma, otras bacterias y virus adventicios por PCR punto final.
El Ensayo Funcional contempla:
– Proliferación
– Viabilidad Celular
– Citotoxicidad
– Apoptosis
– Expresión de receptores
– Métodos colorimétricos
– Fluorescencia

CONCLUSIONES
En México no se libera un lote de biológicos y/o biotecnológicos sin antes ser analizado por un tercer autorizado. El desarrollo de un medicamento implica desde la ciencia básica, la parte pre-clínica en animales hasta la parte de ensayos clínicos que permiten la liberación y posterior registro para su venta, siendo la caracterización de la biomolécula el paso crucial.
Para el 2022 se espera que los productos biológicos y biotecnológicos terapéuticos de uso oncológico sean los de mayor mercado y de mayor crecimiento a nivel mundial.
En la Ingeniería de tejidos las células son básicamente los bloques de construcción, el biomaterial es el soporte que crea una matriz extracelular que da guía y microentorno para interacción entre células. La impresión de órganos en 3D requiere un mayor desarrollo en la generación de órganos complejos.
Respecto a la terapia con células madre, aún NO está aprobada a nivel mundial, es RE-CELL la que tiene autorización en mayor número de paíces como Canadá, México y Europa para regeneración de piel.

El proceso estandarizado de caracterización de líneas celulares son pruebas de control de calidad que permiten establecer la estabilidad genética y fenotípica de un cultivo celular y la ausencia de contaminación cruzada.
REDES

 

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